نيتروژن ميباشد. همچنين PH محيط کشت تحت تاثير نمک هاي غير آلي،منبع کربوهيدرات، عامل ژني، زغال فعال و روش نگهداري محيط کشت قرار ميگيرد(اون و همکاران،1991).
pH محيط کشت را با اضافه کردن اسيد کلريدريک و يا سود 1 نرمالروي(03/07/5)تنظيم مي کنيم (اسميت، 1381 ).
3-2-1 اکسين:
اکسين مصنوعي(NAA) پايدارتر از IAA طبيعي است در اکثرکشتهاي سلولي براي تقسيم و ريشه زايي لازم است. غلظت بالاي اکسين مي تواند مانع ريخت زايي گردد(هنگ و موراشيگ،1976).
3-2-2سيتوکنين (BAP):
باعث تسريع تقسيم سلولي، تشکيل اندام هوايي و ريخت زايي ميشوند(ميلرواسکوگ،1953،1961).
3-2-3 ويتامينها:
نقش کاتاليزوري در واکنشهاي آنزيمي دارند. ويتامين مهم براي کشت سلولهاي گياهي، ويتامين 1 B است. ويتامينهاي ديگراسيد نيکوتينيک (B3) وپيرودوکسين(B6) به محيطهاي کشت سلولي اضافه ميشوند چون ممکن است پاسخ سلولهاي گياهي به کشت را افزايش دهند.
کربو هيدراتها: سلولهاي سبز کشت شده،معمولا از نظر فتوسنتزي فعال نبوده و به يک منبع کربن نياز دارند. ساکارز و يا گلوکز به طور معمول در کشت بافت استفاده ميشوند.
3-2-4 ميواينوزيتول:
يک هگزيتول است که در کشت بافتهاي گياهي با اهميت است(پلارد و همکاران،1961،استين هارت و همکاران،1962). ميواينوزيتول در چرخه بيوسنتز، ذخيره ترکيبات پلي هيدريک به عنوان اندوخته، انتقال قند، تغذيه معدني، متابوليسم کربوهيدراتها، ساختمان غشا، تشکيل ديواره سلولي، پايداري هورموني و فيزيولوژي تنش دخالت دارد(لووس و لورس،1983). همچين باعث افزايش رشد کشتهاي اين ويترو ميگردد و ممکن است بعنوان يک منبع کربوهيدرات باشد. بهعلت مشکلات ناشي ازآلودگي زياددر ريز نمونههاي گياهي، افرادزيادي اقدام به افزودن قارچ کشها و باکتري کشها به محيط کشت نمودهاند(تارستن وهمکاران،1979). معمولا اين ترکيبات به علت سمي بودن براي گياه خيلي استفاده نميشوند و آلودگي نيز به محض حذف اين ترکيبات از محيط کشت ميتواند ظاهر شود.
3-2-5 عامل ژلي:
پس از تنظيم pH آگار به محيط کشت اضافه مي شود. نوع آگار مي تواند روي پاسخ آزمايش ها تأثير بگذارد( گريفيس،1991). پس از حل شدن آگار محيط کشت را درون ظروف کشت توزيع کرده و به مدت 15 دقيقه در دماي 121 و فشار Psi 15 ( 1.03 بار ) سترون شد( اسميت، 1381). محيط هاي کشت بعد از 24 ساعت قابل استفاده اند، تا اگر آلودگي در محيط کشت وجود داشته باشد مشخص شود.
3-3 روش تهيه گياه پايه استريل:
در اين مرحله با استفاده از برگهاي جوان بنفشه آفريقايي که به قطعات کوچک 0.5 در0.5 سانتيمتر تقسيم شدند مورد استفاده قرار گرفت.
3-3-1 مراحل سترون سازي
3-3-2 سترون سازي برگها :
ابتدا برگهاي نه خيلي جوان و نه خيلي پير را انتخاب کرده و سپس به قطعات کوچکتر تقسيم ميکنيم در ادامه مراحل آماده سازي قطعات برگ: 1- شتشوي قطعات برگي در محلول آب و چند قطره مايع شوينده به مدت 5 دقيقه 2- انتقال برگها به محيط داراي آب ژاول به نسبت 1/4 به 3/4به مدت 10-15 دقيقه 3- انتقال برگها از محيط آب ژاول به محيط آب دو بار تقطير، و سپس سه بار پاساژ هر کدام به مدت 5 دقيقه. بعدازانجام مراحل فوق در شرايط کاملا استريل در کنار شعله توسط پنس، درون هر شيشه سه الي چهار قطعه برگ، در نقاط مختلف آگار به صورت پشت و رو قرار داده شد. دهانه شيشه با پارافيلم و يا سلوفن مسدود گرديد و به اتاقک رشد انتقال داده شد بعد از 4 هفته کالوس ايجاد شد و بعد از 4 هفته ديگر که اکسپلنتها به اندازه کافي رشد کرده بودند از آنها براي واکشت و افزايش جداکشتها استفاده شد.

اشکال3-1: نمايي از کالوس(سمت راست) وگياهچه بنفشه آفريقايي حاصل ازآن(سمت چپ)

3-3-3 سترون سازي محيط و وسايل کار:
جهت کار کشت اندام و بافت گياهي وجود مکاني عاري از آلودگي لازم و ضروري است. درغير اينصورت محيط کشت دچار آلودگي شده و از بين مي رود. براي ايجاد فضاي سترون جهت انتقال بذرها و ريزنمونه ها، از اتاقک لامينارايرفلو استفاده شد( ايوانز، 1385).
اتاقک لامينارايرفلو جريان دائمي از هواي سترون شده در محيط کار ايجاد مي کند. اين دستگاه داراي صافي ريز با کارايي بالا (Hepa) با قطر منافذ حدود M ? 0.2 است، که باعث حذف باکتري ها و اسپور قارچ ها مي شود.اين اتاقک داراي منبع نور UV براي ضد عفوني سطح محيط کار است که 15 دقيقه قبل از شروع کار روشن شده و هنگام کار با دستگاه منبع UV خاموش مي شود.حداقل 30 دقيقه قبل از شروع کار جريان هواي سترون شده به صورت دائمي برقرار مي شود.سطح محيط کار قبل و بعد از استفاده با اتانول070/0 ضد عفوني مي شد( ايوانز، 1385).پس از ضد عفوني سطح اتاقک، شيشه هاي حاوي محيط کشت و لوازم مورد نياز جهت انتقال بذر يا ريز نمونه به زير هود منتقل شد.پنس اسکالپل و همچنين تعداد زيادي کاغذ A4 را در فويل آلومينيومي پيچيده و در دماي (121)درجه سانتيگراد به مدت 15 تا 20 دقيقه اتوکلاو مي نمائيم و بلافاصله آنها را به زير هود منتقل کرديم. پس از انتقال به زير هود پنس و اسکالپل را درون شيشه حاوي الکل 96 0/0 قرار داده به طوري که حدود يک سوم آنها بيرون از الکل باشد. وسيله آغشته به الکل را قبل از استفاده روي شعله گرفته و صبر نموده تا قبل از استفاده سرد شود( اسميت، 1381). شيشه هاي محيط کشت را با الکل 0.070 ضد عفوني کرده و در زير هود قرار داديم. پيش از استفاده از دستگاه و باز کردن درب محيط هاي کشت لازم است که دست ها را با آب صابوني گرم شستشو داده و با الکل 70 0/0 ضد عفوني کرده تا از آلودگي دستگاه جلوگيري شود( اسميت، 1381).
3-4 توليد گياهان سترون جهت تيمارهاي مختلف:
از آنجا که هدف از اين پژوهش بررسي اثر غلظت هاي مختلف NacL بر روند رشد گياه بنفشه آفريقايي مي باشد، لذا توليد گياهچه هاي سترون حاصل از مرحله اول ضروري است. برگها در محيط کشت MS داراي هورمون به ميزان mg/l NAA 1و mg/l BAP 0.08 به مدت چهار هفته کالوس و سپس جداکشتها يا اکس پلنت ها توليد يافتند.در گام بعدي محيط هاي پايه MS تهيه و سپس اکسپلنت ها ساب کالچر يا واکشت داده شدند، و به اتاقک رشد منتقل گرديدند.
3-5 کشت گياه در محيط هاي تيماري:
پس از يک ماه که گياهان سترون بدست آمدند، گياهان را به قطعات کوچکتر تقسيم نموده و در محيط هاي تيماري با غلظت هاي متفاوت از NaCl که هر تيمار شامل ( 0، 0.5، 1، 1.5، 2، 4)ميلي گرم برليتر قرار داديم، سپس به اتاق کشت در درون آزمايشگاه منتقل شدند. نور بوسيله لامپ هاي فلورسنت کم مصرف آفتابي 70 و 23 وات و مهتابي 60 و 23 وات که در فاصله 30 سانتيمتري از کف شيشه ها قرار گرفتند، فراهم شد. مقدار نور بکار رفته بين 6000-4000 لوکس بود. دوره نوري 16 ساعت روشنايي و 8 ساعت تاريکي و دماي بهينه در نظر گرفته شد، مدت تيمار دهي 30 روز بود. سپس آناليز داده ها در قالب طرح کاملاً تصادفي با سه تکرار و تجزيه تحليل آ ماري با نرم افزار SPSS ويرايش 16 انجام شد، تجزيه واريانس داده ها با استفاده از آزمون ANOVA و ميانگين داده ها نيز با استفاده از آزمون چند دامنه اي دانکن مقايسه شدند، و براي رسم نمودارها از نرم افزار Excel استفاده گرديد، و نتايج به صورت جداول و نمودارهاي مقايسه اي ارايه شد.
3-6 آناليز رشد:
گياهان بنفشه آفريقايي مطابق روش 3-5 کشت داده شدند. جهت بررسي رشد گياه، پس از 30 الي40 روز گياهان از محيط کشت خارج شدند و بخش هايي از گياه که در محيط کشت قرار داشت قطع شد و به سرعت توزين بخش هاي مختلف گياهي از جمله اندام هوايي، به منظور بدست آوردن وزن تر اين اندام ها بر حسب گرم، طول ساقه بر حسب ميلي متر و فاصله ميانگره بر حسب ميلي متر، تعداد برگ، ، مساحت سطح برگ ها بر حسب سانتي متر مربع انجام شد. عمل خشک کردن نمونه هاي گياهي در آون 70 درجه سانتي گراد به مدت 48 ساعت صورت گرفت. وزن خشک نمونه ها بر حسب گرم با ترازوي حساس بدست آمد. پارامترهاي ديگر رشد به روش زير محاسبه شدند: L.A.R (Leaf Area Ratio) : عبارت است نسبت سطح برگي، که نشان دهنده سطح فتوسنتز کننده به وزن خشک کل گياه است، برحسب cm2.Kg-1 وزن خشک گياه بيان شده است.LAR=SLA LWR همچنين طبق اين فرمول هم بدست مي آيد: در اين رابطه LA کل سطح بافت هاي فتوسنتز کننده و TDW وزن خشک کل گياه است.ميانگين L.A.R عبارت است از: با توجه به معادلات و مقادير R.G.R, N.A.R, L.A.R مي توان نوشت: RGR= NAR × LAR
3-7 سنجش رنگيزه هاي فتوسنتزي (آرنون، 1957):
مطابق با روش 3-5 گياهان بنفشه آفريقايي کشت داده شدند و براي سنجش رنگيزه هاي فتوسنتزي مورد استفاده قرار گرفتند. بدين صورت که 0.1 گرم برگ معلوم گياه را جدا نموده و در هاون چيني همراه با 5 ميلي ليتر استون 80 0/0سائيده شد و محلول به درون لوله سانتريفوژ منتقل گرديد. با دور g 4800 به مدت 20 دقيقه لوله ها، سانتريفوژ شده تا عمل جداسازي انجام گيرد، سپس حجم نهايي عصاره را با 5 ميلي ليتر ديگر از استون 80 0/0، به 10 ميلي ليتر رسانده شد. در اين مرحله جهت محاسبه تراکم کلروفيل هاي a و b جذب محلول در طول موج هاي 645 و 663 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتري با توجه به وزن تر هر نمونه بر حسب ميلي گرم وزن تر ارزيابي گرديد
. 645A 0.00269 – 663 A ×0.0127 = غلظت کلروفيل a 663 A ×0.0046-645 A×0.0229= غلظت کلروفيل b 663A ×0.00802+ 645A × 0.0202= غلظت کلروفيل (a+b) 645A = ميزان جذب در طول موج 645 663A = ميزان جذب در طول موج 663
3-8 سنجش کربوهيدرات (کوچرت،1978):
مطابق با روش 3-5 گياهان بنفشه آفريقايي کشت داده شدند و براي اندازه گيري قندهاي محلول و نامحلول به روش فنل – اسيد سولفوريک، مورد استفاده قرار گرفتند.
3-8-1 اندازه گيري قندهاي محلول:
روش فنل – اسيد سولفوريک بر اساس هيدروليز اسيدي قندهاي محلول و ايجاد ترکيب فورفورال قرار دارد که با فنل توليد يک ترکيب کمپلکس رنگي مي کند. براي انجام آزمايش 0.1 گرم از ماده خشک اندام هوايي گياه را با ترازوي دقيق به دقت 0.01 گرم وزن کرده، در لوله آزمايش ريخته بر روي آن 10 ميلي ليتر اتانل 70 0/0 اضافه کرده و به مدت يک هفته در يخچال قرار داده شد تا قندهاي محلول آن حل شود. پس از يک هفته از محلول رويي نمونه ها 0.5 ميلي ليتر برداشته و حجم آن با آب مقطر به 2 ميلي ليتر رسانده شد. روي آن 1 ميلي ليتر فنل 5 درصد اضافه کرده، خوب به هم زده مي شود و بر روي آن 5 ميلي ليتر اسيد سولفوريک غليظ با فشار اضافه شد، محلول زرد رنگي بدست مي آيد که به مرور تغيير رنگ مي دهد و به قهوه اي روشن تمايل پيدا مي کند، اين محلول را نيم ساعت در دماي آزمايشگاه قرار داده تا هم خنک شده و هم رنگ نهايي به دست آيد. ( زيرا واکنش به شدت گرما زاست ) سپس شدت رنگ حاصله با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 485 نانومتر خوانده مي شود. ميزان جذب حاصله متناسب با شدت رنگ محلول و آن هم متناسب با غلظت قندهاي محلول خواهد بود. مقادير قند نمونه ها با استفاده از منحني استاندارد بر اساس ميلي گرم بر وزن خشک ارزيابي مي شود. براي تعيين غلظت قندهاي محلول، ابتدا لازم است منحني استانداردي با استفاده از غلظت هاي معلوم گلوکز تهيه گردد و معادله منحني تغييرات غلظت هاي قندهاي محلول بدست آيد تا با استفاده از آن بتوان غلظت هاي نامعلوم محلول هاي مورد مطالعه را تعيين و نتايج را مورد بررسي قرار داد.
براي اين منظور غلظت هايي از گلوکز ( 0، 1، 2، 3 و 4 ) ميلي گرم بر ليتر تهيه کرده و به روي هر يک از آنها يک ميلي ليتر فنل 5 درصد و 5 ميلي ليتر اسيد سولفوريک غليظ اضافه کرده، پس از نيم ساعت جذب آنها را با اسپکتروفتومتر

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید