خوانده و معادله خطي آن را محاسبه کرده و سپس منحني استاندارد قند رسم مي شود. در پايان جذب هاي خوانده شده محلول نمونه هاي گياهي را در معادله خط حاصل قرار داده، مقدار قندهاي محلول نمونه هاي مجهول بر حسب ميلي گرم در ليتر تعيين مي شود.
3-8-2 اندازه گيري قندهاي نامحلول ( نشاسته ):
محلول اتانول محتوي نمونه هاي گياهي را که براي قندهاي محلول استفاده شد، صاف نموده و از رسوب باقيمانده بر روي کاغذ صافي براي اندازه گيري نشاسته موجود در اندام هاي گياهي استفاده مي شود. ابتدا رسوب را خشک و سپس آن را وزن نموده و در لوله ي آزمايش ريخته و بر روي آن 10 ميلي ليتر آب مقطر اضافه نموده و به مدت 15 دقيقه در بن ماري آب جوش قرار داده مي شود. سپس آب آن را صاف نموده و حجم محلول عبور کرده از صافي را با آب مقطر به 25 ميلي ليتر رسانده مي شود. در نهايت ml 2 ميلي ليتر از اين محلول برداشته، قندهاي نامحلول آن را به روش فنل – اسيد سولفوريک در طول موج 485 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده و با استفاده از منحني استاندارد و معادله به دست آمده، قندهاي محلول و قندهاي نامحلول تعيين مي شوند.
3-9 سنجش پرولين (باتيس و همکاران، 1973):
الف) تهيه معرف A ( اسيد نينهيدرين ): 1.25 گرم نينهيدرين را به 30 ميلي ليتر اسيد استيک خالص افزوده و مخلوط حاصل را در دماي پايين گرم نموده تا نينهيدرين به خوبي در اسيد حل شود، سپس 20 ميلي ليتر اسيد فسفريک 6 مولار به محلول اضافه مي گردد. اين معرف در دماي 4 درجه سانتيگراد فقط به مدت 24 ساعت قابل استفاده مي باشد. معرف B- اسيد استيک خالص معرف C- تولوئن ب) انجام آزمايش: 0.5 گرم بافت تر گياهي را وزن نموده در 10 ميلي ليتر محلول 3 0/0 اسيد سولفوساليسيليک سائيده، مخلوط همگن حاصل را با استفاده از کاغذ واتمن شماره 2 صاف نموده و از هر کدام از محلول هاي حاصل 2 ميلي ليتر برداشته و در لوله آزمايش ريخته مي شود. سپس به هر يک از لوله هاي محتوي عصاره گياهي، 2 ميلي ليتر معرف اسيد نينهيدرين و 2 ميلي ليتر اسيد استيک خالص افزوده مي شود. در مرحله ي بعد کليه لوله ها را در بن ماري با دماي 100 درجه سانتيگراد قرار داده و پس از يک ساعت لوله ها را بيرون آورده، جهت قطع آزمايش در حمام يخ قرار داده تا لوله ها سرد شوند و به هر کدام 4 ميلي ليتر تولوئن افزوده و لوله ها با استفاده از شيکر، به شدت تکان داده مي شوند. سپس با ثابت نگاه داشتن لوله ها به مدت 20 ثانيه دو لايه کاملاً مجزا تشکيل مي شود. از لايه رنگي فوقاني که حاوي تولوئن و پرولين است، جهت اندازه گيري غلظت پرولين استفاده مي شود. مقدار معيني از اين بخش جدا شده را در دستگاه اسپکتروفتومتر قرار داده و در طول موج 520 نانومتر مقدار جذب را قرائت نموده و مقدار پرولين موجود با استفاده از منحني استاندارد محاسبه مي شود. اين منحني بر اساس خواندن جذب محلول هايي از پرولين با غلظت معلوم تهيه و بر اساس آن معادله محاسبه غلظت پرولين مجهول به دست مي آيد.
جدول 3-7. جذب هاي خوانده شده براي تهيه منحني استاندارد پرولين
2
1
0.3
0.2
0
غلظت پرولين (C)
0.432
0.148
0.081
0.054
0.009
جذب هاي خوانده شده (O.D)

3-10 سنجش فعاليت آنزيمي
3-10-1 سنجش آنزيم پراکسيداز (کوري1989)
کشت گياهان بنفشه آفريقايي مطابق با روش 3-5 انجام گرفت و براي سنجش فعاليت آنزيمي مورد استفاده قرار گرفتند. الف) تهيه محلول عصاره گيري مخلوط 1.2 گرم تريس، 0.1 گرم اسيد آسکوربيک 17.2گرم ساکارز، 0.1 گرم سيستئين کلرايد و 26.8 ميلي ليتر اسيد کلريدريک 0.2 نرمال را با آب مقطر به حجم 100 ميلي ليتر با 7.5 = pH رسانده مي شود. محلول فوق در يخچال نگهداري مي شود. ب) استخراج عصاره آنزيمي: يک گرم از بافت تر گياهي برگ را وزن نموده با 5 ميلي ليتر محلول عصاره گيري سائيده تا عصاره همگن تهيه گردد. سپس آن با به مدت 10 دقيقه در حالت سکون قرار داده سپس به مدت نيم ساعت با قدرت g5000 سانتريفوژ مي شود. ج) سنجش فعاليت آنزيم به منظور سنجش فعاليت آنزيم پراکسيداز از محلول هاي زير استفاده مي شود:
1) 2 ميلي ليتر تامپون استات 0.2 مولار با 4.8 = pH
2) 0.2 ميلي ليتر آب اکسيژنه 3 0/0
3) 0.1 ميلي ليتر بنزيدين (M 0.02 – محلول در متانول 50 0/0)
محلول هاي فوق را به همراه 0.1 ميلي ليتر از محلول عصاره گيري ( حاوي آنزيم پراکسيداز ) را با هم مخلوط نموده و در دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 530 نانومتر ميزان جذب آن خوانده مي شود.
مقدار فعاليت آنزيم بر حسب واحد جذب در دقيقه به ازاء هر ميلي گرم پروتئين در گرم وزن تر محاسبه
مي شود.
3-10-2. سنجش آنزيم کاتالاز (چانز،1955)
به منظور سنجش فعاليت آنزيم کاتالاز، از محلول هاي زير استفاده مي شود.
1) 2.5 ميلي ليتر تامپون فسفات با 7= pH
2) 0.3 ميلي ليتر آب اکسيژنه 3 0/0
محلولهاي فوق را به همراه 0.2 ميلي ليتر از محلول عصاره گياهي با هم مخلوط نموده و دردستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 530 نانومتر، ميزان جذب آن خوانده مي شود.
3-11. سنجش پروتئين ها (لاوري و همکاران، 1951)
الف) براي تهيه معرف هاي مورد نياز بافر تريس به منظور سنجش پروتئين ها به صورت زير عمل مي نماييم.
1) معرف A : ابتدا 2 گرم سود در 100 ميلي ليتر آب مقطر حل شده ( سود 5/0 نرمال ) سپس 10 گرم کربنات سديم توزين و به سود 0.5 نرمال تهيه شده اضافه گرديد. به اين ترتيب معرف A کربنات سديم 10% حاصل گرديد.
2) معرف B) مقدار يک گرم سولفات مس آبدار CuSO4. 5H2O توزين و حجم آن با آب مقطر به 100 ميلي ليتر رسانده شد به اين ترتيب معرف B، سولفات مس 1% بدست آمد.
3) معرف C: براي تهيه آن مقدار 2 گرم تارتارات سديم- پتاسيم در مقداري آب حل شده و حجم آن با آب مقطر به 100 ميلي ليتر رسانده شد به اين ترتيب معرف C سديم پتاسيم تارتارات 2 0/0 حاصل گرديد.
4) معرف D: براي تهيه اين معرف به ترتيب مقادير 10، 0.5 و0.5 ميلي ليتر از معرف هاي A ، B، C با يکديگر مخلوط گرديدند.
5) معرف E: از فولين 2 نرمال رقيق شده با آب مقطر با نسبت 10، استفاده شد. معرف هاي D، E به صورت تازه در هنگام آزمايش تهيه شدند.
6) بافر تريس: از مخلوط کردن 50 ميلي ليتر تريس 0.2 نرمال، 26.8 ميلي ليتر اسيد کلريدريک 0.2 نرمال، 17.2 گرم ساکارز، 0.1 گرم اسيد آسکوربيک و 0.1 گرم کلروسيستئين در حجم نهايي 100 ميلي ليتر با آب مقطر بدست آمد. pH محلول در 8 تنظيم شد.

ب) انجام آزمايش
1) 0.02 گرم ماده خشک گياهي را در يک هاون چيني به وسيله 0.5 ميلي ليتر بافر تريس به خوبي سائيده شد و سپس محتويات به درون لوله سانتريفوژ منتقل گرديد و هاون چيني با 0.5 ميلي ليتر ديگر از بافر تريس شسته شده و به لوله سانتريفوژ منتقل گرديد. 2) با استفاده از دستگاه سانتريفوژ با دور g500 به مدت 40 دقيقه، لوله سانتريفوژ شده تا عمل جداسازي انجام گيرد. سپس بخش رويي به منظور استخراج پروتئين به يک لوله آزمايش منتقل شد. 3) در اين مرحله 50 ميکروليتر از محلول رويي هر نمونه برداشته شده و در يک لوله آزمايش ديگر به روي آن 950 ميکروليتر آب مقطر اضافه گرديد( لوله شماره 1). 4) در يک لوله آزمايش ديگر ( لوله شماره 2) به عنوان شاهد مقدار يک ميلي ليتر آب مقطر و بعد داخل هر دو لوله يک ميلي ليتر از معرف D تهيه شده اضافه گرديد و سپس به مدت 15 دقيقه در دماي آزمايشگاه قرار گرفتند.
5) پس از آن به هر يک از دو لوله، مقدار 3 ميلي ليتر معرف E اضافه و به شدت تکان داده شد. 6) در نهايت لوله هاي مذکور به مدت 10 دقيقه در بن ماري و در حرارت 40 درجه سانتيگراد قرار گرفته و پس از خارج کردن از بن ماري 20 دقيقه در دماي آزمايشگاه قرار داده شدند. 7) سپس با سرد کردن تدريجي لوله ها، به وسيله اسپکتروفتومتر جذب نمونه ها در طول موج 750 نانومتر در مقابل شاهد دستگاه خوانده شد. 8) براي محاسبه غلظت پروتئين هاي مجهول از معادله حاصل از منحني استاندارد پروتين سرم آلبومن گاوي با تراکم هاي 0، 0.1، 0.2، 0.3، 0.4، 0.5 ميلي گرم در ليتر استفاده شد و مقدار جذب در طول موج 750 نانومتر بدست آمد. سپس با استفاده از روش هاي آماري معادله و منحني جذب برحسب غلظت رسم گرديد و بر اساس آن مقادير کل نمونه ها ارزيابي شد.
جدول 3-8. جذب هاي خوانده شده براي تهيه منحني استاندارد پروتئين
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
غلظت پروتئين (C)
0.504
0.424
0.314
0.207
0.085
0.04
جذب خوانده شده (OD)

فصل چهارم

نتايج تحقيق

4-1 اثر غلظتهاي مختلف کلريد سديم بر خصوصيات مورفولوژيکي و رويشي گل بنفشه آفريقايي
براي بررسي اثرات غلظتهاي کلريد سديم از محيطهاي فاقد اين ماده و نيز به ترتيب(0 ، 0.5 ، 1 ،1.5 ، 2 ،4) ميلي گرم بر ليتر استفاده شد و نتايج حاصله اين گونه رقم خورد. در محيط فاقد کلريد سديم گياه با تراکم فوق العاده (تعداد جوانهها) زياد، سطح برگها کوچک و طول دمبرگها نسبتا بلند و رنگ برگها به صورت سبز روشن (کمرنگ) بودنند. در محيط تيمار شده با 0.5 تا 2 ميلي گرم بر ليتر گياه رشد خوبي در مقايسه با شاهد داشته است، طول دمبرگها دراز ، رنگ برگها سبز تيره و همچنان تعداد برگهازياد بود. در محيط تيمار شده با 1.5 ميلي گرم بر ليتر رشد بسيار خوبي در مقايسه با محيط فاقد کلريد سديم مشاهده گرديد. در اين غلظت طول دمبرگها خيلي زياد و به رنگ سبز تيره ، ضخامت برگها زياد وتعداد جوانهها نسبت به شاهد کمتر شده بودنند. اما هر چه به غلظت کلريد سديم اضافه شد سطح برگها افزايش قابل توجهي پيدا کردند و رنگ آنها همچنان سبز تيره بود .طول دمبرگ تا غلظت 2 ميلي گرم بر ليتر بلند اما بعد از آن کوتاه شد. در غلظت نمکي 4 ميلي گرم بر ليتر طول دمبرگها کاهش زيادي پيدا کردند و تراکم (تعدادجوانهها) بسيار کم شد ، حاشيه برگها حالت سوختگي پيدا کردند و سطح برگها نسبت به شاهد افزايش چشمگيري يافت.

شکل 4-1 تصاوير گل بنفشه آفريقايي در تيماربا غلظتهاي مختلف کلريد سديم . a -تيمار با غلظت صفر(شاهد).b -تيمار با غلظت 0.5 ميلي گرم بر ليترC – تيمار با غلظت 1 ميلي گرم بر ليتر. d – تيمار با غلظت 1.5 ميلي گرم بر ليترe – تيمار با غلظت 2 ميلي گرم بر ليتر.f – تيمار با غلظت 4 ميلي گرم بر ليتر

4-2 نتايج حاصل از اثرات مختلف کلريد سديم پس از 40 روز تيمار در محيط کشت پايه MS
4-2-1 تغييرات حاصل از اثرات تيمار با غلظتهاي مختلف کلريد سديم در پارامترهاي رشد
4-2-1-1 تغييرات وزن تر اندام هوايي در گياه 40 روزه بنفشه آفريقايي:
در بررسي نتايج حاصل از توزين وزن کل اندام هوايي گياه بنفشه آفريقايي در تيمار با NaCl درپايه MS که مقداراين ماده بين (0 ، 0.5 ، 1 ، 1.5 ، 2 ،4 ) ميلي گرم بر ليتر بوده است در سطح 0.5 P? معني دار بود و با افزايش شوري ميزان وزن تر گياه نسبت به شاهد 0 ميلي گرم بر ليتر افزايش معني داري داشت . بالاترين درصد وزن تر مربوط به تيمار 4 ميلي گرم بر ليتر و کمترين مربوط به تيمار َ1.5 ميلي گرم بر ليتر قابل مشاهده بود. اما تيمارهاي(0 ،0.5، 1.5 و 2) ميلي گرم بر ليتر اختلاف معني داري با هم نداشتند. و همچنين اختلاف معني داري بين تيمار 2 و 4 ميلي گرم بر ليتر وجود داشت. در رابطه با وزن تر گياه اختلاف معني داري بين شاهد و تيمار 4 ميلي گرم بر ليتر وجود داشت. بين تيمار شاهد و 1 ميلي گرم بر ليتر اختلاف معني داري وجود داشت که نسبت به شاهد وزن تر بيشتر بود . بين تيمار 1 و 4 ميلي گرم بر ليتر نيز اختلاف معني داري

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید