همکاران ،2002 ؛Pastori and Foyer،2002 ؛ Apel and Hirt،2004؛ Mandhania و همکاران ،2006). کاهش صدمات اکسيداتيو ميتواند مقاومت گياه به استرس را بهبود بخشد . در تنش شوري ،سلولهاي گياهي براي تنظيم تراکم ROS درون سلولي، مکانيسمهاي جاروب کننده آنزيمي شامل سوپر اکسيد ديسموتاز(SOP)، کاتالاز(CAT)، آسکوربات پراکسيداز(APX)، گلوتاتيون -S- ترانسفراز(GST) ،گلوتاتيون پراکسيداز(GPX)و … را ارائه ميدهند(Mittler،2002؛ Mittova و همکاران ،2003 ؛ حسين و همکاران،2008). گر چه توان اين آنزيمها محدود است و براي جاروب کامل ROS کافي نيست ولي ارتباط ميان ميزان اين آنزيمها و تحمل نمک اثبات شده است(Parida and Das ،2005). Hernandez و همکاران در سال 2000 گزارش دادند در گياه گندم تحت تنش شوري، غعاليت آنزيمهاي آنتي اکسيداني نظير آسکوربات پراکسيداز، گلوتاتيون ردوکتاز و Mn – سوپراکسيداز ديسموتاز افزايش مييابد،در حاليکه Cu/ Zn سوپر اکسيد ديسموتاز ثابت ميماند و تمامي مقادير آسکوربات و گلوتاتيون کاهش مييابد. در برگهاي برنج، تنش نمک منجر به بالا رفتن ميزان H2O2 و افزايش فعاليت سوپر اکسيد ديسموتاز،کاتالاز کاهش مييابد، به عبارت ديگر استرس شوري اثر کمي بر فعاليت گلوتاتيون ردوکتاز دارد(Lee و همکاران،2001). گياه گوجه فرنگي ،در غلظتهاي بالاي نمک افزايش فعاليت سوپر اکسيداز ديسموتاز، کاتالاز ،پراکسيداز و سوپراکسيداز ديسموتازرا افزايش ميدهد( Rodrigues-Rosales و همکاران،1999). عنوان شده است که شوري باعث افزايش فعاليت آسکوربات پراکسيداز وگلوتاتيون ردوکتاز وسوپر اکسيد ديسموتاز در گياه برنج ميشود(Parida وهمکاران،2004). ميزان بالايي از آسکوربات آندوژن براي پايداري سيستم هاي آنتي اکسيداني غير آنزيمي ضروري است که گياه را از صدمات اکسيداتيو ناشي از نمک حفظ ميکند(Shigeoka وهمکاران،2002).
2-2-4 اثر شوري بر اسموليتها:
در وضعيت هاي تنش،گياهان نيازمندند که پتانسيل آب دروني خود را نسبت به خاک پايين نگه دارند تا عمل تورژسانس وجذب آب براي رشد و بقاء گياه ادامه پيدا کند(Tester and Davenport ،2003). جهت تطبيق تعادل يوني در واکوئلها ترکيباتي با جرم مولکولي کم در سيتوپلاسم انباشته ميشوند.اين مولکولهاي کوچک آلي براي متابوليسم سلول سمي نيستند و با واکنشهاي بيوشيميايي معمولي در سلول مداخله نميکنند ودر جهت سازگاري گياه با شرايط استرس انباشته ميشوند(Zhifang and Loescher،2003). با انباشته شدن مقادير مناسبي از آنها ساختارهاي سلولي وتعادل اسمزي حمايت شده و با افزايش فشار اسمزي سلول، عمل جذب آب ادامه يافته ويا خروج آنها کاهش مييابد(Yancey،2005؛ Hasegawa و همکاران ،2002). بعضي از اين اسموليتهاي سازشي، يونهاي ضروري نظير پتاسيم و برخي مواد آلي محلول هستند (Yokoi و همکاران،2002). اين مواد آلي در موجودات زنده و حتي بين گونههاي گياهي بسيار متفاوت بوده و شامل مواد زير هستند:
-قندهاي ساده(بطور عمده گلوکز وفروکتوز)
-قند الکلها(گليسرول واينوزيتول)
-قندهاي مرکب(ترهالوز ورافينوز)
-مشتقات آمينو اسيد(پرولين،گليسين بتائين، بتا الانين)
-ترکيبات سولفونيوم(دي متيل سولفونيم پروپيرونات)
(Bohnert and Jensen،1963؛Yokoi و همکاران2002 ؛Zhifang and Loescher ،2003).
2-2-5 اثر شوري بر پرولين:
بيو سنتز پرولين در گياهان داراي دو مسيراست:
-مسيرL-اورنيتين
-مسيرL-گلوتامات
سنتز پرولين در گياهان از دو مسير گلوتامين اسيد واورنيتين صورت ميگيرد. بررسيهاي انجام شده با مواد نشاندار نشان دادهاند که مسير گلوتاميک اسيد مسير اصلي بيوسنتزدر شرايط تنش اسمزي است. تغييرات ميزان پرولين وپلي آمينها در پاسخ به تنشها بسيار مهم ميباشد، زيرا هر دوي آنها براي پيشنياز اوليه که گلوتاميک است، رقابت ميکنند.گلوتامات بهوسيله چرخه GS-GO-GAT توليد ميشود و به طورمستقيم آنزيم گلوتامات-1-دلتا پرولين 5کربوکسيلات به پرولين تبديل ميشود(هاريس واشرف،2004). گياهان معمولا” اسموليتهاي سازگارداراي جرم مولکولي کم نظيرپرولين را در خود انباشته ميکنند (Harris and Ashraf ،2004؛Tripathi و همکاران،2007). تجمع پرولين يکي از متداولترين پاسخها در طيف وسيعي از استرسهاي زيستي و غير زيستي نظير شوري ميباشد (Aghaei و همکاران، 2009). پرولين از طريق برهمکنش با آنزيمها باعث محافظت از ساختار و پايداري فعاليت آنها ميشود(Kishor و همکاران،2005). پرولين با جاروب کردن راديکالهاي هيدروکسيل موجب پايداري پروتئينها، غشاها واندامکهاي درون سلول شده و پس از رفع تنش نيز به عنوان مخزن کربن، انرژي و نيتروژن بکار ميرود(Harinasul وهمکاران،2000). استرس شوري منجر به افزايش تجمع پرولين در ريشه واندام هوايي برنج، ريشه نخود، اندام هوايي گندم(Tobitaوهمکاران،2001)، چغندرقند، گوجهفرنگي، کلزا وتوت سفيد ميشود(Wainchananan و همکاران،2003). تنش شوري، ميزان پرولين را در لپهها و محور روياني دانه رستهاي بادام زميني افزايش ميدهد که اين امر ناشي از افزايش فعاليت آنزيم کاماگلوتاميل کيناز است. اين آنزيم نقش مهمي را در سنتز پرولين به عهده دارد(Girija وهمکاران،2002). در سويا افزايش 7،12،20 برابري پرولين به ترتيب 50،100،200 ميليمول نمک گزارش شده است(Amirjani،2010). پرولين در استحکام غشاء وتخفيف اثر نمک بر ازهمگسيختگي غشاء مشارکت دارد(Mansour،1998). پرولين نسبت به ساير اسيدهاي آمينه در گياهان تحت تنش به مقدار بيشتري جمع ميشود ودرپايداري غشا هاي سلولي شرکت داشته و اثرات مخرب NaCl روي غشاهاي سلول تعديل مينمايند(Ashraf and Harris،2004). البته توانايي گياهان در انباشتن پرولين در شرايط استرس، بين گونهها يا حتي واريتهها متفاوت است( Stewart،1980؛Wyn Jones and Gorham،1984). پرولين يکي از متداولترين اسموليتهاي سازگار در گياهان تحت تنش ميباشد و با واکنشهاي شيميايي عادي تداخل ندارد(Aziz and Khan،2003؛Tobita و همکاران،2001). گزارش شده است پرولين تحت شرايط تنش چندين نقش را بازي ميکند.به عنوان يک اسموليت، مخزن کربن، انرژي ونيتروژن براي شرايط بعد از استرس،جاروب کننده راديکال هيدروکسيل و حفاظت کننده آنزيمها واندامکها ونيز کاهش دهنده اسيديته به کار ميرود(Harinasul و همکاران ،2003).

فصل سوم

مواد و روشها

3-1 تهيه محلول هاي ذخيره و محيط کشت:
انتخاب محيط کشت يا تهيه فرمولاسيون آن براي موفقيت در کشت بافت ضروري است. هيچ محيط کشت مشخصي را نمي توان براي رشد انواع سلول ها توصيه کرد و اغلب لازم است تغييراتي در محيط کشت براي پاسخگويي انواع مختلف ريز نمونه صورت گيرد. (اسميت، 1381). بيشتر گونه هاي گياهي به محيط هاي کشت متفاوتي نياز دارند، از اين رو انتخاب محيط کشت مناسب براي يک گونه با مشکلات فراواني همراه است( معيني، 1382). کاربرد محيط کشت MS به دليل بسياري از گياهان به آن عکس العمل مناسبي نشان مي دهند بسيار متداول است(پيريک، 1376). براي بکار بردن اين موارد در ساخت يک ليتر محيط کشت لازم است که ابتدا محلول هاي مادري تهيه شود.
3-1-1 محلول هاي مادري نمک هاي پرمصرف با غلظت 10 برابر ( ):
از آنجا که محيط تيماري در اين پژوهش نمک هاي پرمصرف NH4NO3, MgSO4 بود، براي هر يک از نمک هاي پرمصرف، محلول مادري جداگانه اي طبق جدول زير تهيه شده، محلول ها در يخچال و دماي نگهداري شدند( نصيري، 1377).
جدول 3-1 نحوه تهيه و شرايط نگهداري نمک هاي پرمصرف محيط کشت پايه MS
شرايط نگهداري
مقدار محلول مادر براي يک ليتر محيط کشت (ml)
مقدار ماده لازم در ml100 محلول مادر (mg)
مقدار ماده لازم براي يک ليتر محيط کشت (mg)
نمک

10
19000
1900
KNO3

10
16500
1650
NH4NO3

10
4400
440
CaCl2.2H20

10
1700
170
KH2PO4

10
3700
370
MgSO4.7H2O

3-1-2 محلول هاي مادري نمک هاي کم مصرف با غلظت 1000برابر (1000 × )
نمک هاي کم مصرف غير از Na2.EDTA.2H2O, FeSO4. 7H2O بصورت يک محلول مادري تهيه و در دماي درون يخچال نگهداري شد.
جدول 3-2. نحوه تهيه و شرايط نگهداري نمک هاي کم مصرف محيط کشت پايه MS
شرايط نگهداري
مقدار محلول مادر براي يک ليتر محيط کشت (ml)
مقدار ماده لازم در ml1000 محلول مادر (mg)
مقدار ماده لازم براي يک ليتر محيط کشت (mg)
نمک

1
22300
22.3
MnSO4.4H20

25
0.025
CuSO4.5H20

8600
8.6
ZnSO4.7H2O

830
0.83
KI

25
0.025
CoCl2.6H20

6200
6.2
H3BO3

250
0.25
Na2MoNa.2H2O
3-1-3 محلول مادري Na2. EDTA.2H2O , FeSO4. 7H2O با غلظت 10 برابر (10 × )
نمک کم مصرف FeSO4.7H2O به همراه Na2.EDTA.2H2O بصورت يک محلول مادري جداگانه با غلظت 10 برابر تهيه و در دماي درون يخچال نگهداري شد. اين محلول بايستي در مقابل نور محافظت شود، بنابراين لازم است پس از تهيه در يک بطري تيره رنگ نگهداري شود( اسميت، 1381).
جدول 3-3- نحوه تهيه و شرايط نگهداري Na2. EDTA.2H2O , FeSO4. 7H2O محيط کشت پايه MS

شرايط نگهداري
مقدار محلول مادر براي يک ليتر محيط کشت (ml)
مقدار ماده لازم در ml100 محلول مادر (mg)
مقدار ماده لازم براي يک ليتر محيط کشت (mg)
نمک

10
278
27.8
FeSO4.7H2O

373
337.3
Na2.EDTA.2H2O

3-1-4 محلول مادري ويتامين ها و گلايسين 100 برابر (100 ×) :
جهت تهيه محلول مادري ويتامين ها، ويتامين هاي تيامين در فريزر به صورت منجمد نگهداري شد.
جدول 3-1- نحوه و شرايط نگهداري ويتامين هاي محيط کشت پايه MS
شرايط نگهداري
مقدار محلول مادر براي يک ليتر محيط کشت (ml)
مقدار ماده لازم در ml100 محلول مادر (mg)
مقدار ماده لازم براي يک ليتر محيط کشت (mg)
نمک

1
10
0.1
Thiamin.HCI

50
0.
Nicotinc acid

50
0.5
Pyridoxine.HCI

200
2
Glycine

3-1-5 محلول مادري هورمون ها:
در پژوهش کنوني مبناي ساخت محلول هاي هورموني که بهترين پاسخ را در شکل گيري ساقه بنفشه آفريقايي نشان داده اند mg/L NAA 1 و mg/L BAP 0.08 مي باشد. محلول هاي مادري پس از تهيه در يخچال نگهداري شدند.
جدول 3-5 نحوه تهيه و شرايط نگهداري هورمون هاي مورد استفاده در محيط کشت پايه MS
شرايط نگهداري
مقدار محلول مادر براي يک ليتر محيط کشت (ml)
مقدار ماده لازم در ml100 محلول مادر (mg)
مقدار ماده لازم براي يک ليتر محيط کشت (mg)
نمک

1
50
1
NAA

1
100
0.08
BAP
3-2 تهيه يک ليتر محيط کشت پايه MS از محلول هاي مادري:
جهت ساخت يک ليتر محيط کشت پايه MS از محلول هاي مادري ترکيبات عناصر پرمصرف و آهن ml 10، ترکيبات عناصر کم مصرف، ويتامين ها و هورمون ها هر کدام ml 1 برداشته، سپس 30 گرم ساکارز، 0.1 گرم ميواينوزيتول و 0.5 گرم بنوميل ( قارچ کش ) به آنها اضافه مي شود. pH همه ي محيط هاي کشت بايد پس از اضافه کردن تمامي مواد ( به غير از آگار ) تنظيم شود. ( ايوانز، 1385). pH قبل و بعد از اتوکلاو کردن متفاوت است. اگر pH اوليه، بين 5 تا 7 باشد، معمولاً حدود 0.3 تا 0.5 واحد پايين مي آيد(اسکيروين،1986). در pH پايين تر از 5.5 آگار به طور مناسب ژلاتيني نمي شود و در pH بالاتر از 6 ژل به صورت خيلي محکم تشکيل مي شود. موراشيگ1973). کاهش pH در کشت بعضي بافتهاي گياهي به علت توليد اسيدهاي آلي يا مصرف

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید